第二代DNA测序技术的操作流程（二代测序工作安全吗）

第二代DNA测序技术的操作流程？

操作流程如下：

1、测序文库的构建

首先准备基因组，然后将DNA随机片段化成几百碱基或更短的小片段，并在两头加上特定的接头。

如果是转录组测序，则文库的构建要相对麻烦些，RNA片段化之后需反转成cDNA，然后加上接头，或者先将RNA反转成cDNA，然后再片段化并加上接头。

2、锚定桥接

Solexa测序的反应在叫做flowcell的玻璃管中进行，flowcell又被细分成8个Lane，每个Lane的内表面有无数的被固定的单链接头。

上述步骤得到的带接头的DNA片段变性成单链后与测序通道上的接头引物结合形成桥状结构，以供后续的预扩增使用。

3、预扩增

添加未标记的dNTP和普通Taq酶进行固相桥式PCR扩增，单链桥型待测片段被扩增成为双链桥型片段。

通过变性，释放出互补的单链，锚定到附近的固相表面。

通过不断循环，将会在Flowcell的固相表面上获得上百万条成簇分布的双链待测片段。

4、单碱基延伸测序

在测序的flowcell中加入四种荧光标记的dNTP、DNA聚合酶以及接头引物进行扩增，在每一个测序簇延伸互补链时，每加入一个被荧光标记的dNTP就能释放出相对应的荧光，测序仪通过捕获荧光信号，并通过计算机软件将光信号转化为测序峰，从而获得待测片段的序列信息。

5、数据分析

这一步严格来讲不能算作测序操作流程的一部分，但是只有通过这一步前面的工作才显得有意义。

测序得到的原始数据是长度只有几十个碱基的序列，要通过生物信息学工具将这些短的序列组装成长的Contigs甚至是整个基因组的框架，或者把这些序列比对到已有的基因组或者相近物种基因组序列上，并进一步分析得到有生物学意义的结果。

二代测序工作安全吗？

二代测序工作是安全的。

第二代测序技术的核心思想是边合成边测序（SequencingbySynthesis)，即通过捕捉新合成的末端的标记来确定DNA的序列，现有的技术平台主要包括Roche/454FLX、Illumina/SolexaGenomeAnalyzer和AppliedBiosystemsSOLIDsystem。

pcr与二代测序关系？

二代测序需要pcr。

Pcr是一个链式扩增反应。

而二代测序中需要用到pcr技术。

来扩增目的片段，从而达到建库的要求。

单细胞测序和三代测序有什么区别？

第一代测序：

指双脱氧末端终止法，扩增后通过毛细管电泳读取序列，每次获取数据量少。

2.

第二代测序：

为高通量测序，采用微珠或高密度芯片边合成边测序，代表有454，solexa，solid，高通量，可一次获得数G数据，相对与第三代，都仍然需要扩增的方法放大信号，扩增后再检测。

3.

第三代测序：

特点是单分子测序，多基于纳米科技，无需扩增，对单分链DNA/RNA直接用合成、降解、通过纳米孔等方式直接测序，核心特点是无需扩增所以成本更低。

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