动物组织提取基因组DNA的步骤和试剂

动物组织提取基因组DNA的步骤和试剂？

一、实验原理

真核生物的一切有核细胞（包括培养细胞）都能用来制备基因组DNA。

真核生物的DNA是以染色体的形式存在于细胞核内，因此，制备DNA的原则是既要将DNA与蛋白质、脂类和糖类等分离，又要保持DNA分子的完整。

提取DNA的一般过程是将分散好的组织细胞在含SDS（十二烷基硫酸钠）和蛋白酶K的溶液中消化分解蛋白质，再用酚和氯仿/异戊醇抽提分离蛋白质，得到的DNA溶液经乙醇沉淀使DNA从溶液中析出。

蛋白酶K的重要特性是能在SDS和EDTA（乙二胺四乙酸二钠）存在下保持很高的活性。

在匀浆后提取DNA的反应体系中，SDS可破坏细胞膜、核膜，并使组织蛋白与DNA分离，EDTA则抑制细胞中Dnase的活性；而蛋白酶K可将蛋白质降解成小肽或氨基酸，使DNA分子完整地分离出来。

二、仪器及试剂

1.仪器：

恒温水浴锅、台式离心机、紫外分光光度计（GeneQuant）、移液器、玻璃匀浆器、离心管（灭菌）、吸头（灭菌）

2.试剂：

（1）细胞裂解缓冲液：

Tris(pH8.0)100mmol/L

EDTA(pH8.0)500mmol/L

NaCL20mmol/L

SDS10%

胰RNA酶20ug/ml

（2）蛋白酶K：

称取20mg蛋白酶k溶于1ml灭菌的双蒸水中，?C20℃备用。

（3）TE缓冲液（pH8.0）：

高压灭菌，室温贮存。

（4）酚：

氯仿：

异戊醇（25:24:1）、

（5）异丙醇、冷无水乙醇、70%乙醇、灭菌水。

三、操作步骤

1.取新鲜或冰冻动物组织块0.1g（0.5cm3），尽量剪碎。

置于玻璃匀浆器中，加入1ml的细胞裂解缓冲液匀浆至不见组织块，转入1.5ml离心管中，加入蛋白酶K（500ug/ml）20μl，混匀。

在65℃恒温水浴锅中水浴30min，也可转入37℃水浴12～24h，间歇振荡离心管数次。

于台式离心机以12000rpm离心5min，取上清液入另一离心管中。

2.加2倍体积异丙醇，倒转混匀后，可以看见丝状物，用100ul吸头挑出，凉干，用200ulTE重新溶解。

（可进行PCR反应等，需要进一步纯化的按下列步骤进行）

3.加等量的酚：

氯仿：

异戊醇振荡混匀，离心12000rpm，5min。

4.取上层溶液至另一管，加入等体积的氯仿?异戊醇，振荡混匀，离心12000rpm，5min。

5.取上层溶液至另一管，加入1/2体积的7.5mol/L乙酸氨加入2倍体积的无水乙醇，混匀后室温沉淀2min，离心12000rpm,10min。

6.小心倒掉上清液，将离心管倒置于吸水纸上，将附于管壁的残余液滴除掉。

7.用1ml70%乙醇洗涤沉淀物1次，离心12000rpm，5min。

8.小心倒掉上清液，将离心管倒置于吸水纸上，将附于管壁的残余液滴除掉，室温干燥。

9.加200ulTE重新溶解沉淀物，然后置于4℃或?C20℃保存备用。

10.吸取适量样品于GeneQuant上检测浓度和纯度。

四、常见问题

1.选择的实验材料要新鲜，处理时间不易过长。

2.在加入细胞裂解缓冲液前，细胞必须均匀分散，以减少DNA团块形成。

3.提取的DNA不易溶解：

不纯，含杂质较多；加溶解液太少使浓度过大。

沉淀物太干燥，也将使溶解变得很困难。

4.电泳检测时DNA成涂布状：

操作不慎；污染核酸酶等。

5.分光光度分析DNA的A280/A260小于1.8；不纯，含有蛋白质等杂质。

在这种情况下，应加入SDS至终浓度为0.5%，并重复步骤2～8。

6.酚/氯仿/异戊醇抽提后，其上清液太黏不易吸取：

含高浓度的DNA，可加大抽提前缓冲液的量或减少所取组织的量。

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