基因表达载体构建步骤（2023已更新）为什么要构建表达载体

说起表达载体构建，会有不少人想要了解，那么下面来看看表达载体构建的有关内容。

基因表达载体构建步骤

操作步骤如下：

1、用一定的限制酶切割质粒，使质粒出现缺口，露出黏性末端；

2、再用同一种限制酶切断目的基因，使其产生相同的黏性末端；

3、将切下的目的基因的片段插入质粒的切口处；

4、再使碱基互补配对结合，两个黏性末端吻合在一起，碱基之间形成氢键；

5、再加入适量的DNA连接酶，催化两条DNA链之间形成磷酸二酯键，从而将相邻的脱氧核糖核酸连接起来，形成一个重组DNA分子。

为什么要构建表达载体

1、得到大量的DNA，虽然PCR也可以，但PCR扩增有出错率、但你每做一次常规的PCR，而且每次都要重新提DNA和RNA才行，而且，PCR反应的试剂盒又不便宜，用PCR来制备大量DNA有点得不偿失。尽管构建克隆载体也存在操作复杂（相对于PCR），成功率不是极高，而且还要筛选，但一旦你重组成功并转入了大肠杆菌，你就可以保存了，你想什么时候用，摇个菌，就可以制备到大量的DNA。

2、测序需要。你想转表达，你首先得确定你扩增的目的片段是不是你要的，不要以为你设计了个特异性引物，然后跟你mark的长度就可以确定了，这也只是推测，在科学上不严谨。扩增出的基因片段保险起见或者经费允许，要拿去测序，而一般送测的序列都是构建到载体上的序列，克隆载体上一般也都带有测序引物，已确定这就是你要的那条序列。你要写论文必须要给人真凭实据。

完整的基因表达载体包括哪些

启动子、RNA酶的结合部位终止子、一段有特殊结构的DNA短片段、转录结束的标志目的基因、标记基因、共重组DNA的鉴定和选择复制原点、DNA复制起点E（DNA聚合酶结合位点）。

基因表达载体的构建（即目的基因与运载体结合）是实施基因工程的第二步，也是基因工程的核心。其构建目的是使目的基因能在受体细胞中稳定存在，并且可以遗传给下一代，同时，使目的基因能够表达和发挥作用。

什么叫限制酶切割位点

基因工程中的构建基因表达载体需用到限制酶和DNA连接酶，限制酶会识别限制酶切割位点(即某个DNA序列，如AACC--TTGG，当然，不同的限制酶作用位点不一)，限制酶能将磷酸二酯键切断，不是随便切断，而是特定的。

人工合成牛胚胎是什么

通过胚胎工程实现，优良品种的快速大量繁殖、改良当地落后品种、节省大量引进的资金等。人工合成牛胚胎的方法：获取目的基因主要方法从基因文库中直接获取目的基因和人工合成目的基因（利用PCR技术扩增）。在构建基因表达载体时，目的基因和质粒要有互补的黏性末端，才能连接，所以要用同一种限制酶去切割。将目的基因导入牛的受精卵，受体细胞是动物细胞，要用显微注射法。，导入的受体细胞是细菌，要用CaCl2溶液处理大肠杆菌，使其成为感受态细胞。

为了使受体母牛超数排卵应注射适量的促性腺激素。把细胞培养至桑椹胚或囊胚期，进行胚胎移植，这是胚胎工程的最后一道工序。经过基因工程和胚胎移植等技术目的是要获得能分泌含人胰岛素牛奶的母牛，这是符合要求的个体。

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